İspanyol fatih Don Nuño Beltrán de Guzmán'ın bu topraklar üzerindeki hakimiyetini ve gücünü artırmak için ülkenin batı topraklarına yönelik sürekli saldırıları, Yeni Galiçya Krallığı adında yeni bir eyaletin kurulmasıyla sonuçlandı.
Bölgede, İspanyolların içinde kurduğu yerleşim yerlerini sürekli olarak tahrip eden çeşitli yerli gruplar yaşıyordu. Nuño de Guzmán'ın teğmeni, Yüzbaşı Juan B. de Oñate, 5 Ocak 1532'de tamamladığı bir gerçek olan, bu bölgeleri yatıştırmak ve Villa de Guadalajara'yı Nochistlán adlı yerde kurmak için emir aldı. Şehre sık sık yerli saldırıları nedeniyle bir yıl sonra Tonalá'ya ve daha sonra Tlacotlán'a taşınmak zorunda kaldı. Şehrin, 14 Şubat 1542'de Cristóbal de Oñate'nin Yeni Galiçya valisi ve Don Antonio de Mendoza'nın varlığıyla kesin olarak kurulduğu Atemajac Vadisi'ndeki kasabaya yerleşmek için üçüncü bir transfer yapıldı. Miguel de Ibarra belediye başkanı ve vali yardımcısını atayan Yeni İspanya genel valisi.
Şehir hızla gelişti ve o zamanlar dini ve sivil güçlerin merkezi olan Compostela (bugünkü Tepic) ile rekabet etmeye başladı, böylece Guadalajara sakinleri Audiencia yetkililerine öyle bir baskı uyguladılar ki kral Felipe II, Compostela'dan Guadalajara'ya, Katedral'e, Kraliyet Mahkemesi'ne ve Hazine yetkililerine taşınmak için 10 Mayıs 1560 tarihli Cédula çıkarmaya karar verdi.
Kentsel yapı, diğer kolonyal şehirlerinkine göre planlandı, bu nedenle düzeni, San Fernando meydanından bir satranç tahtası şeklinde geliştirildi. Daha sonra Mexicaltzingo ve Analco mahalleleri Fray Antonio de Segovia ve en eskilerinden biri olan Mezquitán mahallesi tarafından kuruldu. Belediye binası evleri de mevcut San Agustín tapınağının ve Adalet Sarayı'nın bulunduğu ilk kilise kilisesinin önüne inşa edildi.
Bugün, kolonyal yapılarda üretken olan görkemli şehir, 1561 ve 1618 yılları arasında mimar Martín Casillas tarafından inşa edilen, mutlaka görülmesi gereken bir yer olan Katedral gibi çok sayıda ilgili mimari örneği sergiliyor. Onun tarzı yeni başlayan barok olarak sınıflandırıldı. Sağlam yapısı, binanın orijinal tarzına ait olmasalar da şu anda Guadalajara'nın başkentinin sembolü olarak kabul edilen ilginç kuleleriyle bugünkü Plaza de Guadalajara'nın önünde yükseliyor. İlkel kuleler on dokuzuncu yüzyılda bir depremle yıkılmış ve bugün sahip oldukları kuleler eklenmiştir. Tapınağın içi, dantelden yapılmış tonozları da dahil olmak üzere yarı Gotik tarzdadır.
16. yüzyıldan kalma diğer dini bölgeler, Analco mahallesinde nehrin yakınında 1542 yılında kurulan ve Reformasyonda neredeyse tamamen yıkılan San Francisco manastırlarıdır. 17. yüzyılın sonunda yenilenen tapınağı, mütevazı Solomonik çizgilerden oluşan Barok cephesi ile korunmuştur. San Agustín manastırı, 1573 yılında II. Felipe Kraliyet Kararnamesi tarafından kuruldu ve şu anda şiddetli Herrerian çizgileri ve iç kısmı nervürlü tonozlarla tapınağını koruyor.
Geleneksel vakıflardan biri olan Santa María de Gracia, 1590 yılında Plaza de San Agustín'in önünde inşa edilen ve masrafları Hernán Gómez de la Peña tarafından ödenen Puebla'dan Dominik rahibeleri tarafından işgal edildi. İnşaat altı bloğu işgal etmeye başladı, ancak bugün yalnızca tapınağı varlığını sürdürüyor ve 18. yüzyılın ikinci yarısından kalma neoklasik bir cepheye sahip.
